定量吸光度分光光度法

对于学生和光谱仪的新用户而言，运用吸光度分光光度法必须先了解比尔-朗伯定律。 无论是定量还是定性，我们都可以运用比尔-朗伯定律。

前言

吸光度分光光度法可定性识别“指纹”物质，或定量测量透明溶液中有色物质（发色基团）的浓度。 一些情况下，需要明确知道未知物质的绝对吸光度或消光系数。 另一些情况下，可以根据公式确定未知物相对于已知浓度标准溶液的浓度。 在这两类情况下，吸光度的推导就叫比尔-朗伯定律。

实验条件

分光光度计测量吸光度的方法是将波长为 λ的平行光通过一块平面平行物质，然后测量该透过的光束，对于液体样品，我们可以选择盛放在比色皿中。由于一部分能量被样品中的分子吸收，样品的入射光（I0）的强度要高于透过样品的光（I）。

结果

透射率（T）（表示为百分比）是一个比率关系：

不透明样品的透射率为0%，而透明样品的透射率为100%。 若光路中有具有光吸收能力的分子，透射率将低于100%。 与光相互作用的分子数量取决于光程（I）和分子浓度（C）。 衰减效应也取决于分子吸收该波长光线的能力，表示为消光系数或摩尔吸收系数。

吸光度（Aλ）是指光通过溶液或某一物质前的入射光强度与该光通过溶液或物质后的透射光强度比值的并以10为底的对数。 换算成浓度、光程与吸光度的关系如下：

完全透明的样品的吸光度为0（T=100%），完全不透明的样品的吸光度为无穷大（T=0%）。 ε的数值取决于c的单位。 c的单位一般是摩尔浓度（摩尔/升），l的单位为厘米，那ε的单位（升/(摩尔·厘米）。

结论

空气/样品界面和样品/比色皿的界面的光反射以及溶液的光吸收都会减弱光强度。可分别定量分析这些因素，但通过将I0定义为通过空白样品或对照样品的光，可以消除这些因素的影响。

要消除空白溶液吸光度的影响，有两种方法可供选择：可以先测量空白溶液的吸光度，然后从样品吸光度中减去这一数值，或将仪器设置为100%T或0吸光度单位后再开始测量。 这与天平去皮重十分类似。

影响比尔-朗伯定律效力的因素很多。通常通过检测一系列标准品的吸光度来确认某一发色基团的线性（见表1的发光团采样）。 这一校准措施还能消除实验、设备和试剂批次造成的误差（诸如光程未知的比色皿）。